Ana-1小鼠巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)步驟

Ana-1小鼠巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)步驟
　　(1) (Ana-1小鼠巨噬細(xì)胞)實(shí)驗(yàn)開始前向小鼠腹腔注射0.5ml含40μg刀豆球蛋白a的磷酸鹽緩沖液（PBS）。

　　(2) 3天后，斷頸處死小鼠，75%酒精消毒小鼠皮膚。

　　(3) 置動(dòng)物于解剖臺(tái)上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。

　　(4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml 無(wú)菌PBS液注入腹腔中，同時(shí)從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)。

　　(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動(dòng)物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)。

　　(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中，1000r/min 4℃離心10分鐘，棄去上清液，重復(fù)兩次，加入完全培養(yǎng)液重懸。

　　(7) 將濾液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn),(Ana-1小鼠巨噬細(xì)胞)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡下計(jì)數(shù)。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度將細(xì)胞以 400μl/孔接種到預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被的24 孔培養(yǎng)板或 100μl/孔接種 96 孔培養(yǎng)板。

　　(8) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24-48 h直到融合。

　　注意事項(xiàng)：

　　腹腔注射時(shí)PBS可以用20ML注射器，每只老鼠注射10ML；切勿注射入內(nèi)臟，會(huì)使腹腔液中紅細(xì)胞增多，同時(shí)可能污染；注射后，要多揉一下再取液；

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